马里奥受邀前往碧琪公主的城堡，但到达后发现公主不见了。他从奇诺比那里得知，库巴再次绑架了碧琪，并对城堡施加了魔法，囚禁了她的臣民。现在，马里奥必须打破魔法并救出碧琪。 《超级马里奥64》是首款完全采用3D图形的马里奥游戏。核心玩法延续了之前的平台跳跃元素，包括跳跃、躲避障碍和击败敌人。玩家可以在没有时间限制的情况下探索各个关卡，收集星星以解锁新区域，最终进入库巴城堡的不同部分。每层击败库巴可以获得钥匙，打开大门进入其他楼层。 马里奥在本作中有了更多动作技能，除了跑跳外，还可以行走、蹲伏、爬行、攀爬和攻击敌人。他还能进行二段跳、三段跳、长跳、壁跳和后空翻等动作。在水下时，马里奥的氧气会逐渐减少，需要捡起某些物品来解决谜题。 游戏中有三种帽子道具： 翅膀帽：让马里奥飞行； 金属帽：使马里奥免疫伤害（包括毒气等环境危害）； 隐形帽：让马里奥可以穿过特定障碍物（如铁丝网）。 此外，马里奥还可以进入大炮被发射出去，结合飞行能力可以到达高处区域。